一、植物抗病基因工程策略

近年来，由于对植物抗病反应机制及植物病原菌致病机理的深入研究，为植物抗病基因工程策略的制定提供了基础和依据。植物和病原菌的相互作用经历识别、信号传递和防卫反应3个环节后，最终的互作表现为感病或抗病则取决于植物和病原菌双方的特性。所以植物抗病基因工程可以通过下面不同的技术路线来实现。

1．在植物与病原菌识别水平上进行调控来激活植物抗病机制 根据基因对基因理论，只有当植物中抗病基因产物与病原菌中相对应的无毒基因产物相互识别后才能诱导抗病反应。在植物抗病基因的利用上可以从以下几方面考虑：首先，根据已有的R基因结构特征设汁新的R基因。对已有的R基因研究资料发现，R基因都是高度保守的，它们具有共同的功能区域。其次，进行异源表达R基因。抗病遗传工程中一个激动人心的研究领域是在种间进行R基因转移，这也是用传统的育种方法所难以达到的。第三，可以向一株植物中导人多个R基因。在同一品种中导人多个R基因或超表达一个R基因都可能使植物对付多种病原且使植物抗性持久化。

在无毒基因的利用上，研究较多的是植物病毒无毒基因的转基因。另外，也可以把病原菌的无毒基因和与之相对应植物的抗病基因一起导人植物中，在特定的条件下可刺激两者同时表达，相互作用后激发植物的抗病反应。与植物抗病信号传递有关基因的利用是获得植物广谱抗病的一种有效策略。不同植物的抗病过程可能涉及到许多不同的信号传递通道，而在不同信号的传递过程中，可能存在着共同的枢纽基因，这些基因对下游的多种防卫反应起重要的调控作用。

目前在拟南芥中已鉴定了多个系统获得抗性(SAR)途径发生改变的突变体，并克隆到了多个对植物防卫反应具有调控作用的基因，如NPRl等。

2．导入植物防卫反应基因，增强植物抗病性 在植物抗性中，抗病基因产物只是一个效应因子，它是通过激活防卫反应起抗病作用的。因此可以直接导人植物防卫反应基因，使其在植物中表达，从而提高植物抗病能力。植物的防卫机制极其复杂，主要包括PR蛋白、水解酶类和植保素的产生等方面，有关基因都可以通过分子操作导人植物中。

3．导入降解病原菌致病因子的基因使植物抗病植物病原菌产生的毒素是一类重要的致病因子，但产毒素菌却具有自身保护机制，使其免受毒素的毒害。人们设想从病原菌中克隆降解毒素基因，并把这种基因导入植物，使转基因植物能抵抗毒素菌产生的侵染，提高植物的抗性。目前，已成功地克隆了烟草野火病 菌的烟草毒素(tabtoxin)降解酶基因乙酰转移酶基因ttr和菜豆晕斑病菌的菜豆萎蔫毒素(phaseolotoxin)降解酶基因鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因。

4．导入其他抗菌蛋白(肽)基因以增强植物抗病性

(1)抗菌肽。抗菌肽对细菌病害的作用效果较好，它的作用机制为：通过抗菌肽分子多聚体插入细胞膜形成离子通道，导致细胞膜内外的离子浓度失控而杀死细胞，一些真核细胞对抗菌肽不敏感。抗菌肽的广谱杀菌能力使其成为植物抗细菌病害基因工程的一种有用策略，转抗菌肽基因工程主要集中于双子叶的烟草和马铃薯以及单子叶的水稻。

(2)硫素。离体条件下，硫素对一些植物病原菌有毒性，被认为与植物对病原真菌和细菌的抗性有关。转硫素基因的烟草表现出对P．s．pv．tabaci较好的抗性。

二、植物抗病基因工程成就

1．解毒基因工程

(1)抗菜豆毒素的转基因工程。菜豆毒素(phaseolotoxin)是由菜豆晕斑病菌(Pseudomonas

s~ingae pr．phaseolicola)产生的非寄主专化性的毒素。产菜豆毒素的Rs．pv．phaseolicola菌株通过argK基因合成一种不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，从而对该毒素不敏感。将argK基因导人烟草和菜豆，获得的转基因烟草和菜豆植株表现出较对照高1-10倍的OCTase活性。当接种P.s.pv．phaseolicola后较对照表现出较好的抗病效果。

(2)抗烟草毒素的转基因工程。引起烟草野火病的Rs．pv．tabaci产生一个二肽的毒素，即烟毒素(tabtoxin)。H．Anzai等(1989)分离到了抗烟毒素的基因nr，将ur基因与CaMV 35S启动子融合成嵌合基因，通过根癌土壤杆菌介导的转化法导人烟草中，所获得的转基因烟草植株中nr基因表达水平很高，对tabtoxin处理及病原菌的侵染均表现出了良好的抗性。

2．抗菌蛋白(肽)基因工程

(1)转抗菌肽基因工程。用花粉管导人法，李乃坚等(1998)将抗菌肽B基因转入烟草，转基因苗浸根接种青枯病细菌(Ralstonia solanacearum)，表现出较好的抗病和推迟发病的特点。cecropin是研究较多的来自柞蚕的一种抗菌肽，对青枯病菌、水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌都有一定的杀菌效果，其转基因植物

研究也取得了较大成功。贾士荣等(1994)和M．Hassan等(1993)向马铃薯中导A．cecropin基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。J．M．Jaynes等(1993)将cecropinB的基因转入烟草后获得的转基因植株，提高了对由R．solanacearum引起的病害的抗性。但R．Highthower等(1994)将cecropin基因转化烟草后获得的转基因植株对Ps．pv．tabox'i所引起的青枯病抗性则没有变化。黄大年等(1997)将cecropinB和cecropinD的基因通过基因枪法导入水稻幼胚，获得的转基因水稻植株可明显提高对水稻白叶枯病菌的抗性，同时也获得了高抗水稻细菌性条斑病和水稻白叶枯病的高抗株系。

(2)转硫素基因的基因工程。M．J．Carmona等(1993)将来源于大麦基因组克隆的硫素基因和来源于小麦cDNA克隆的硫素基因转化到烟草中，获得了较对照有不同表型的转基因烟草植株。转基因植株接种Rs．pv．tabaci后，对照株和低表达转基因株在接种点形成了55％-75％的坏死斑，而较高表达水平的转基因烟草在接种点只形成了5％-30％的病斑，且病菌的生长也被强烈抑制，但并未完全被抑制。

3．植物抗病相关基因工程

(1)水稻抗白叶枯病的转基因工程。G．L．Wang等(1996)通过微弹轰击法，将水稻抗白叶枯病菌基因Xa21导人感病品系O．sativasp·Japonica var Taipei 309，测定了来自印度、印度尼西亚、哥伦比亚、中国、菲律宾、尼泊尔、朝鲜和泰国等8个国家的32个水稻白叶枯病菌菌株在T1转基因系、受体品种TP309，以及原初抗病品种IRBB21上的致病表型变化。结果发现，其中29个菌株在T1植株和IRBB21上均不能引起感病反应，而且转基因植株至少对16个菌株的抗性较IRBB21有所提高，但在所有32个菌株中，3个来自朝鲜的菌株则能克服这些转基因水稻的抗性，产生致病反应。

(2)番茄抗斑点病的转基因工程。番茄抗斑点病的基因存在于一个多基因的基因家族中。研究较清楚的抗病及相关基因有Pro、pff、Fen和Pti等。

(3)NPRl的转基因工程。H．Cao等(1997)用作图克隆法获得了拟南芥的NPRl基因，并进行了转拟南芥基因工程研究，获得了广谱抗病的拟南芥植株。NPRl基因是植物防卫反应调控基因，它的转基因研究给植物抗病性研究带来了新的视点，在实践中具有重要意义。令人振奋的是NPRl蛋白类似物在多种经济上重要的植物中得到鉴定，并已从烟草和番茄中分离到了与NPRl基因同源的cDNA克隆，它们编码的蛋白与拟南芥NPRl蛋白具有70％氨基酸同源性。这些发现为拟南芥NPRl基因或其他类似基因在其他植物基因工程上的应用提供了依据。

4．植物防卫反应相关基因的基因工程

(1)几丁质酶和1,3-葡聚糖酶基因工程。Bmglie等(1991)在克隆菜豆几丁质酶基因的基础上将CH5B基因修饰改造，通过Ti质粒转化烟草，获得的几丁质酶高效表达的转基因植株，具有协同抗枯萎病菌的效果。

(2)溶菌酶基因工程。T4溶菌酶对革兰氏阴性和阳性菌都有活性，被认为是遗传工程的一个好的可选材料。接种能够引起软腐和黑胫症状的E．carotovora subsp,atroseptica，分别检查接种薯块的浸离和块茎的萌芽情况，结果发现转基因的植株对病原菌的抗性水平提高。尽管T4溶菌酶基因的表达水平较低，但却表现出了较有前途的应用前景。

(3)葡萄糖氧化酶基因工程。植物对病原菌侵染的防卫反应涉及活性氧的产生，其中包括H202。美国孟山都公司将真菌编码葡萄糖氧化酶的基因导人马铃薯中，当葡萄糖氧化时产生H202，在转基因植株中使叶片和块茎中H202水平增加。转基因马铃薯的块茎对由Ecc引起的细菌性软腐病表现出很强的抗性，并且在厌氧和好氧条件下对细菌侵染的抗性都是稳定的。

(4)其他基因工程。核糖体失活蛋白(RIP)是一类能抑制蛋白质生物合成的蛋白，广泛存在于高等植物中，含量丰富。大多数植物和细菌中RIP是通过它的 N-糖苷键活性来实现其抑制蛋白质合成的功能，而真菌中RIP是以其核酸酶活性来起作用的，不同的RIP分别对病毒、真菌、线虫和昆虫具有不同的抗性。孟山都公司的研究人员克隆了编码商陆的RIP基因，通过农杆菌介导，将该基因转入烟草和马铃薯细胞，获得的转基因植株低水平表达RIP时可以防止病毒侵染。

5．病原菌无毒基因工程 病原菌的无毒基因和植物的抗病基因互作后可以导致抗病性的发生，对病毒早期的研究认为病毒的外壳蛋白(CP)基因起着无毒基因的作用。病毒的CP蛋白基因的转基因工作研究较为广泛和深入，多种病毒的CP蛋白基因被克隆，并且已获得多种植物的转CP基因植株，这包括了双子叶植物中的烟草、马铃薯、番茄、欧洲李和杏等作物及单子叶植物中的水稻等。

三、植物抗病基因工程应用前景

随着分子植物病理学的研究深入及生物技术的发展，越来越多的病原菌致病基因及植物抗病相关基因得到克隆，其中不少基因已被用于植物转基因研究，并取得了不少令人惊喜的成就，尤其是植物抗病基因的转基因不失为植物的抗病育种提供了一条捷径。

抗病基因的转基因工程一方面可以大大缩短新品种的育成时间，常规育种通常至少要7-10年时间，而转基因途径育成新品种则需3-4年时间。另外转基因途径还可以进行跨种、属的基因转移，这也是常规育种所难以办到的。但纵观目前所进行的转基因工程研究状况，还存在着一些问题，其中最关键的一点就是要加强对病原菌致病机制和植物抗病机制的深入研究。目前的转基因工作较多的是转化克隆的抗病基因和防卫反应基因，根据基因对基因理论，抗病基因是和相应的无毒基因互作后起作用的，介导的抗性是小种特异性的，向植物中导人某--抗病基因后，它可以对携带特定无毒基因的病原菌产生抗性。在自然界中病原菌的变异较抗病基因变化更快，一旦病原菌的无毒基因改变，转基因植物所介导的抗性也将立即丧失。鉴于此，在应用时仍要注意将导人不同抗病基因的遗传上不同的品种进行合理布局，并密切监测病原菌的种群变化，分析能克服抗病基因的小种出现的频率。在转基因水稻中，Xa21能赋予水稻对来自8个国家的19个水稻白叶枯菌分离物具韦抗性，这一结果突破了其他抗病基因小种专化性的局限，为水稻白叶枯病的抗病基因工程提供了广阔的前景。

防卫反应是植物抗性表现的直接作用因子，近年来大量的防卫反应基因已被克隆，其中许多防卫基因的产物在离体条件下具有良好的抑菌作用，因而这些基因已被广泛用于植物的转基因研究。事实上植物与病原菌的互作是一个很复杂的级链反应，对于每个病害，由于病原菌的侵染行为不同，侵染后的识别存在着各自的特异性，但随后所引起的信号在多数病害中都有共同的组分和传递途径。不同病原菌的无毒基因之间尽管已发现有同源性但其差异终究是普遍存在的，而来自不同作物赋予对不同类型病害抗性的植物抗病基因之间都表现出了惊人的结构和功能上的保守性。这说明不同病害抗性中可能存在着共同的信号传递机制，如果能够对这些共同机制进行深入研究，从信号传递的不同过程进行人为控制，将会在病害抗性研究中产生重要突破。

摘自世界农业